豬瘟藍(lán)耳口蹄疫CSFV/PRRSV-U/FMDV-U熒光PCR說明書

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：豬瘟病毒/豬藍(lán)耳病病毒通用型/口蹄疫病毒通用型(CSFV/PRRSV-U/FMDV-U)核酸檢測試劑盒(實(shí)時熒光-PCR 法)

Name ：Classical swine fever virus / swine ear disease virus universal / foot-and-mouth disease virus universal (CSFV/PRRSV-U/FMDV-U) nucleic acid detection kit (real-time fluorescence -PCR)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

口蹄疫病毒（FMDV）屬小 RNA 病毒科屬，是小的動物病毒之一，在世界范圍廣泛分布，其中，O、A、C 型 FMDV 的毒力和抗原性均易發(fā)生變易，幾乎遍布亞、非、拉、歐各洲；AsiaⅠ型主要分布在亞洲；SATI、SAT2、SAT3 型主要分布在非洲[1-2]?？谔阋卟《狙逍蛷?fù)雜多變，為檢測帶來了較大的難度[3]。

本試劑盒適用于檢測口蹄疫易感動物的水泡皮及水泡液、O/P 液等標(biāo)本中口蹄疫病毒通用型 RNA，適用于口蹄疫病毒通用型感染的輔助診斷。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒對口蹄疫病毒通用型特異核酸序列設(shè)計引物和探針，用一步法熒光RT-PCR 技術(shù)對口蹄疫病毒通用型 RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

名 稱 規(guī) 格

酶液 50μL×1 管

FMDV-U 反應(yīng)液 1.0mL×1 管

FMDV-U 陽性質(zhì)控品 50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品 250μL ×1 管

注：

1）不同批號試劑不能混用。

2）試劑盒內(nèi)各試劑組份足夠包裝規(guī)格所標(biāo)示的檢測次數(shù)。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

病死或撲殺動物，取水泡皮及水泡液；待檢活動物，取 O/P 液 2~3mL。

【保存和運(yùn)輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

水泡皮樣品：稱取水泡皮 0.5g 于研磨器中研磨，加入生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中；OP 液或水泡液樣品，直接取 100μL 置于 1.5mL 滅菌離心管中。

1.2RNA 提取

推薦采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑 FMDV-U 反應(yīng)液 酶液

用量 20μL 1μL

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，21uL/管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道

（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時間 收集熒光信號

1 1 cycle 42℃ 20min 否

2 1 cycle 95℃ 10min 否

3 40 cycles 94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、

stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

6.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無明顯擴(kuò)增曲線丏無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，丏 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無效。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Mulle JD，McEachern JA，Bossart KN，et al. Serotype-independent detection of foot-and-mouth disease virus [J]. J Virol Methods [J].2008，151（1）：146-153.

[2]吳紹強(qiáng).亞歐型及南非型口蹄疫一步法多重?zé)晒?RT-PCR 檢測方法建立[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（14）：3019-3026.

[3]Mason PW，Grubman MJ，Baxt B. Molecular basis of pathogenesis of FMDV [J].Virus Res，2003，91（1）：9-32.

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