禽腦脊髓炎病毒(AEV)熒光PCR核酸檢測試劑盒說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：禽腦脊髓炎病毒(AEV)核酸擴增檢測試劑盒(PCR 熒光探針法)

Name ：Avian encephalomyelitis virus (AEV) nucleic acid amplification kit (PCR fluorescent probe method)

【包裝規(guī)格】48T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測全血等樣本中的禽腦脊髓炎病毒，用于禽腦脊髓炎病毒感染的輔助診斷，其檢測結(jié)果僅供參考。

【檢驗原理】

本試劑盒用一對禽腦脊髓炎病毒特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術(shù)對禽腦脊髓炎病毒的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

2) DNA 的提取也可以采用上海晅科生物科技有限公司生產(chǎn)的 DNA 提取試劑

盒（離心柱提取法），請嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25ul；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）

NONE，請勿選擇 ROX 參比熒光。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

步驟 循環(huán)數(shù) 溫度 時間 收集熒光信號

1 1 cycle 95℃ 10min 否

2 40 cycle

94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5. 結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線；

可疑：檢測通道 35.0<Ct 值≤37，建議重復(fù)檢測，如果檢測通道仍為 35.0<Ct值≤37，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>37 或無 Ct 值。

【標(biāo)本要求】

標(biāo)本采集：用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管

保存運輸：上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標(biāo)本運送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

取抗凝血下層血細胞 50uL，加入 100uL 雙蒸水吹勻

1.2DNA 提取

1) 對上述處理好的標(biāo)本加入等體積核酸提取液（固體標(biāo)本加入50uL核酸提取液），

100℃恒溫處理 10 分鐘，13,000 rpm 離心 5 分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的 1.5ml

EP 管，-20℃保存；

【儲存條件和有效期】

試劑盒保存于-20±5℃，有效期 12 個月；

避免反復(fù)凍融，凍融次數(shù)不超過 5 次；試劑開瓶后，在室溫條件下放置時間不

應(yīng)超過 8 小時；運輸采用干冰（或者冰袋）保持低溫，運輸時間不應(yīng)超過 4 天。試

劑盒生產(chǎn)日期見產(chǎn)品標(biāo)簽。

7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且 Ct 值≤32；

以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

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2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性

對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

試劑 YP 反應(yīng)液 酶液

用量（樣本數(shù)為 N） 20μl 1μl

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μl，分別加入相應(yīng)的反

應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

8. 產(chǎn)品性能指標(biāo)

陰陽性參考品符合率：8 份陽性參考品符合率為 100％；10 份陰性參考品符合

率為 100％。

低檢測限：2.0×102copies/ml。

精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測 Ct 值的變異系數(shù)（CV）均≤3%。

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